海洋细胞毒药物与抗体偶联物的制备及生物活性评价

目的 以抗体N-糖链为偶联位点,制备曲妥珠单抗与海洋细胞毒药物单甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联物,并研究其对乳腺癌细胞BT474的杀伤作用。 方法 合成含叠氮和炔基修饰的唾液酸化寡糖,采用化学酶法制备含叠氮或炔基修饰的曲妥珠单抗,利用生物正交反应分别制备相应的抗体药物偶联物。利用SDS-PAGE 对转糖基及偶联过程进行监测,表面等离子共振技术(SPR)对叠氮或炔基修饰前后抗体与FcγRIIIa亲和力进行检测。利用CCK-8法评价两种抗体药物偶联物对乳腺癌细胞株BT474的杀伤作用。结果 成功制备了含叠氮或炔基修饰的曲妥珠单抗及N-糖链糖基位点抗体药物偶联物,修饰抗体与FcγRIIIa的亲和力较曲妥珠单抗增加,相比曲妥珠单抗,两种抗体MMAE偶联物对BT474有更明显的生长抑制作用。结论 基于抗体糖链末端唾液酸位点偶联的方法可有效应用于海洋细胞毒抗体偶联药物的开发。     

1种绿藻硫酸多糖的化学组成及其结构研究

目的 对1种绿藻硫酸多糖的化学组成及其结构特征进行研究。方法 通过热水提取法,从1种石莼属海藻中提取硫酸多糖,采用强阴离子交换色谱和凝胶渗透色谱对多糖进行分离纯化;采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、高效液相色谱以及化学方法对多糖的纯度、分子量、单糖组成和化学成分进行分析测定;通过红外光谱和气质联用方法对多糖的结构进行表征。结果 多糖HP2S在HPGPC色谱图上呈单一对称峰,分子量为90.5 kDa,硫酸根和糖醛酸含量分别为32.1%和7.4%,HP2S主要由鼠李糖组成,含有少量葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖,HP2S糖链中鼠李糖主要存在形式为(1→2)-Rhap 、(1→3)-Rhap 和(1→2, 3)-Rhap,硫酸根位于(1→3)-Rhap 的C-2位或(1→2)-Rhap 的C-3位上。结论 水溶性多糖HP2S是1种结构新颖的主要由鼠李糖组成的硫酸化多糖。     

离子色谱法测定藻酸双酯钠中游离和结合硫酸根含量

目的建立1种快速、简便、灵敏的离子色谱法测定藻酸双酯钠中游离和结合硫酸根的方法。方法采用氧瓶燃烧法对样品进行有机破坏,将有机硫转化为无机硫酸根,采用离子色谱法测定样品总硫酸根含量;又将样品直接溶解后测定游离硫酸根含量,间接计算样品中结合硫酸根含量。结果硫酸根在0.6~20μg/mL浓度范围内线性关系良好(r2=0.9991),样品重复性RSD     

海参药材质量标准提升的研究

目的 制定山东省地方习用药材海参的质量标准。方法 参照《中国药典》（2020版）相关方法对海参药材进行性状和薄层色谱（TLC）鉴别研究,测定了水分、酸不溶性灰分及浸出物的含量;通过硫酸苯酚法以葡萄糖为对照品测定海参多糖的含量;采用高效液相色谱法（HPLC）对海参药材的特征图谱进行研究。结果 不同批次海参药材的性状特征较一致;TLC斑点清晰,重复性好;海参药材中水分的质量分数为8.5% ~ 9.5%,酸不溶性灰分的质量分数为0.1% ~ 0.2%,浸出物的质量分数范围为33.6% ~ 51.7%;以葡萄糖计海参多糖的质量分数范围为0.52% ~ 0.85%;供试品色谱图中呈现的5个特征峰与对照药材参照物色谱图中的5个特征峰的保留时间相对应。结论 本研究建立的定性及定量方法操作简便、准确、稳定。可用于海参药材的质量控制。     

12种海洋真菌发酵液粗多糖抗流感病毒(H1N1)活性研究

目的从红树林来源的黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)及绮丽穗霉(Spicaria elegans KLA03)的6种培养基发酵液中获得12种粗多糖并评价其抗流感病毒(H1N1)活性。方法运用高效液相色谱(HPLC),红外光谱(IR)等对各粗多糖的单糖组成和基本结构特征进行分析比较;采用犬肾(MDCK)细胞模型结合细胞病变效应(CPE)实验对其体外抗H1N1活性进行评价。结果所有粗多糖均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖,某些多糖还含有氨基葡萄糖、氨基半乳糖或少量木糖与阿拉伯糖;在250μg/mL的浓度下,各多糖呈现了不同的抗H1N1病毒活性,其中AF-3及SEK-4对H1N1抑制率分别达到为69.6%和67.5%。结论通过改变生长条件,从海洋真菌发酵液中得到了2种具有较强抑制H1N1活性的胞外多糖。     

柱前衍生液相色谱法测定藻酸双酯钠的含量

目的建立测定海洋药物藻酸双酯钠(PSS)含量的柱前衍生化高效液相色谱方法。方法利用0.1mol/L稀硫酸将PSS降解为D-甘露糖醛酸(M)和L-古罗糖醛酸(G),并与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行柱前衍生化反应,采用高效液相色谱法测定PSS降解液中M和G的峰面积,以葡萄糖醛酸(GlcUA)为内标,以PSS对照品绘制标准曲线计算含量。色谱柱:Zorbax KP-C18(150mm×4.6mm,5μm),流动相:磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH 7.0)/CH3CN(83/17,体积分数);流速:0.8mL/min;柱温30℃,检测器:可变波长检测器(VWD),检测波长:245nm。结果PSS在0.3～15mg/mL浓度范围内与峰面积比值呈良好的线性关系(R2=0.9966);在低、中、高3个浓度的日内精密度平均RSD为0.78%(n=6),日间精密度平均RSD为3.08%(n=5),重复性RSD为3.24%(n=5),24h内稳定性良好,RSD为2.93%,3个浓度平均回收率为115.77%,方法的最低检测限为0.25μg/mL。结论该方法专属性好,灵敏度高,重复性好,适合PSS的质量控制。     

碱提灵芝多糖的分离纯化、结构表征及免疫活性评价

目的从赤芝Ganoderma lucidum中提取、分离和纯化获得碱提多糖组分,在表征其基本理化性质和精细结构的基础上,对其体外免疫调节活性进行研究。方法赤芝子实体干燥粉碎后,利用碱提醇沉法提取粗多糖,经Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱纯化得到灵芝多糖组分(LZJ-0.15)。采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)及高效凝胶渗透色谱-十八角度激光光散射联用法(HPGPC-MALLS)测定LZJ-0.15的单糖组成及相对分子质量特征,并通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)及二维谱(1H-1H COSY和1H-13C HSQC)对LZJ-0.15的精细结构进行表征。采用小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红实验对灵芝多糖LZJ-0.15进行免疫活性评价。结果 LZJ-0.15的相对分子质量、分子半径及Mw/Mn分别为24 700、46.6 nm和1.019,其单糖组成分析显示以葡萄糖为主(92.3%),核磁谱图显示LZJ-0.15为→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→连接为主的葡聚糖。RAW264.7细胞吞噬中性红实验显示LZJ-0.15具有较好的免疫调节活性。结论赤芝碱提灵芝多糖相较于水提多糖组分具有较优的免疫活性,有望开发成重要的免疫调节剂。     

何首乌多糖的结构表征及其免疫调节活性研究

目的从何首乌Polygonum multiflorum中提取分离多糖,对其结构进行表征,并评价其免疫调节活性。方法采用水提、醇沉法从何首乌中提取粗多糖,经Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换色谱柱分离纯化得到何首乌多糖(PMT)。利用高效凝胶渗透色谱-十八角度激光光散射联用法(HPGPC-MALLS)测定PMT的绝对分子质量,采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定单糖组成。采用二维核磁共振波谱(2D-NMR)对PMT的结构进行表征。采用四甲偶氮唑盐(MTT)法、中性红比色法和Griess法分别检测PMT对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的生长、吞噬活性和释放一氧化氮(NO)能力的影响。结果 PMT是一种α-1,4-葡聚糖,其绝对分子质量为3.96×105。PMT可显著促进RAW264.7细胞的增殖,促进细胞的吞噬能力,增加NO的释放量。结论何首乌来源的α-1,4-葡聚糖具有显著的免疫调节活性,具有药物开发潜力。     

锡兰海木耳多糖的提取、理化性质及抗氧化活性研究

目的 从红藻锡兰海木耳（Sarcodia ceylonensis）中提取多糖,对其化学组成和理化性质进行分析,并进行体外抗氧化活性评价。方法 依次通过冷水、热水（85 ℃）和4% NaOH溶液提取海木耳多糖;通过化学方法测定其总糖和硫酸根含量;利用PMP柱前衍生高效液相色谱法、高效凝胶渗透色谱法、红外光谱等方法对其单糖组成、相对分子质量和结构特征进行分析;通过测定其对超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（?OH）和DPPH自由基的清除作用、对Fe2+的螯合能力和还原能力评价其体外抗氧化活性。结果 3种多糖SCW（冷水提取多糖）、SCH（热水提取多糖）和SCA（碱液提取多糖）的相对分子质量分别为6.65 × 105、2.55 × 105和1.35 × 105;单糖组成相似,均含有半乳糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸,其中3,6-内醚-半乳糖和半乳糖含量均达到20%以上;硫酸根含量较高,分别为12.74%、13.46%和19.76%;3种多糖对O2-、?OH和DPPH自由基均有显著的清除作用,对Fe2+均表现出显著的螯合能力,其中SCA抗氧化活性最强。结论 从锡兰海木耳中提取得到3种硫酸多糖,均具有显著的体外抗氧化活性,为其将来作为食品和化妆品添加剂提供了有用参考。     

扁玉螺多糖的提取、分离和结构分析

目的从扁玉螺(Neverita didyma)中提取和分离纯化多糖,并对其基本理化性质和结构组成进行分析。方法依次采用水提和碱提方法从扁玉螺中提取粗多糖,采用DEAE Sepharose FF阴离子交换和Sephacryl S-300凝胶柱层析对粗多糖进行分离纯化,并对其总糖、蛋白、氨基糖、糖醛酸和硫酸根含量,相对分子质量和单糖组成进行分析。对多糖纯化组分采用甲基化、气质联用(GC-MS)、红外光谱(IR)、电喷雾质谱(ESI-MS)和核磁共振波谱(NMR)对其化学结构进行分析。结果扁玉螺水提粗多糖(BYL-S)中不含有糖醛酸和硫酸基,其单糖组成只含Glc,进一步分离得到了4种水溶性多糖组分。碱提粗多糖(BYL-J)单糖组成相对复杂,除含有Glc外,还含有Man、GlcN、GalN、Gal和Fuc,其摩尔比为Glc∶Man∶GlcN∶GalN∶Gal∶Fuc=78.9∶1.7∶3.4∶2.2∶5.2∶5.6,进一步分离得到了3种多糖组分。对水提多糖纯化组分BYL-S2的结构分析表明其是以α-(1→4)为主链,含有少量β-(1→3,4)和β-(1→3)分支的D-吡喃型葡聚糖。结论从扁玉螺中提取分离得到了7种多糖组分,并确定了一种水溶性葡聚糖的结构,为扁玉螺多糖结构和活性的深入研究提供了基础。